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        細胞培養常見問題及對策

         更新時間:2022-04-18 點擊量:697

        1 冷凍管應如何解凍?

        取出冷凍管后,須立即放入 37 C 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1 鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。

        細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除 DMSO?

        除少數特別注明對 DMSO 敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,應直接放入含有 10-15ml 新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除 DMSO  即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

        可否使用與原先培養條件不同之培養基?

        不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活。

        可否使用與原先培養條件不同之血清種類?

        不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

        何謂 FBS, FCS, CS, HS ?

        FBS (fetal bovine serum) FCS (fetal calf serum)  是相同的意思,兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS (calf serum)  則是指小牛血清。HS (horseserum)  則是指馬血清。

        培養細胞時應使用 5 % 10% CO2?或根本沒有影響?

        一般培養基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統,而培養基 NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的 CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時,細胞培養時應使用 10% CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升 1.5 g 時,則應使用 5% CO2 培養細胞。

        何時須更換培養基?

        視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。

        培養基中是否須添加抗生素?

        除于特殊篩選系統中外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。

        附著性細胞繼代時所使用之 trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

        一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于20 C,避免反復冷凍解凍造 trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。

        10 懸浮性細胞應如何繼代處理?

        一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時,可將培養角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。

        11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?


        欲回收動物細胞,其離心速率一般為 300xg ( 1,000rpm),5 - 10 分鐘,過高之轉速,將造成細胞死亡。

        12 細胞之接種密度為何?

        依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

        13 細胞冷凍培養基之成份為何?

        動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含 5 - 10% DMSO (dimethyl

        sulfoxide)  90 - 95 %原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于

        DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。

        14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?

        冷凍保存使用之 DMSO 等級,必須為 Tissue culture grade DMSO (Sigma D2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于 4 C,避免反復冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質,并可減少污染之機會。若要過濾 DMSO,則須使用耐 DMSO Nylon 材質濾膜。

        15 冷凍保存細胞之方法?

        冷凍保存方法一:冷凍管置于 4 C 30~60 分鐘 → (-20 C 30 分鐘) -80 C16~18 小時(或隔夜) → 氮槽 vapor phase 長期儲存。

        冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降 1-3 C 80 C  以下, 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。*-20 C 不可超過 1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80 C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

        16 細胞欲冷凍保存時,細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

        冷凍管內細胞數目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

        17 應如何避免細胞污染?

        細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染的好方法。

        18 如果細胞發生微生物污染時,應如何處理? 加入相應抗生素,直接滅菌后丟棄之。

        19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?

        不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。

        20 支原體污染會對細胞培養有何影響?

        支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數,代謝及研究任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為 mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。

                21 細胞株有支原體污染時, 該如何處理? 

        直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

        22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?

        定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。



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