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        凝膠過濾層析實驗(GFC)原理、實驗步驟及注意事項

         發布時間:2023/7/7 點擊量:502

        原理

        分子篩色譜又稱凝膠排阻色譜、凝膠過濾和排阻層析,是 20 展來的一種新型的液相層析分離純化方法。它的分離基礎主要根據物質分子大小不同而進行。

        分子篩色譜所用的基質我們通常稱之為好膠,它是具有立體網狀結構且呈珠狀的顆粒物質,每個顆粒猶如一個篩子,當將混合物樣品加入層析柱進行洗脫時,大分子物質不多孔凝膠基質能進入基質內部而沿顆粒間的空隙隨著溶劑流動,由于其流程較短,移動速度快而最先流出柱外;

        小分子物質則可以進入顆粒內部,不斷地在不同的凝膠顆粒間進入與逸出,速度較蛋白混合物慢,最后流出柱外;對于中等大小的分子來說,它們既能在凝膠顆粒內外分布,也能部分進人顆粒,從而在大分子物質與小分子物質之蛋白質按分間被洗脫。

        用途

        根據蛋白質分子量大小和形狀來分離目的蛋白質。

        材料與儀器

        試劑:
        平衡緩沖液為 10 mmol/L Na2HPO4,/NaH2PO4,1.0 mol/LNaclpH7.4)、SDS-PAGE

        材料:層析柱、色譜填料

        儀器:pH 計、勻質機、離心機、蛋白純化儀

        步驟

        100ml 的柱體積實驗為例

        1、先用去離子水將 AKTA 純化儀、柱子沖洗干凈。

        2、用 2 個柱體積 Buffer 平衡柱料。

        3、上樣:以流速 1±0.2ml/min 的速度上樣。

        4、再用 Buffer 以流速 1±0.2ml/min 的速度進行沖洗。

        5、在 AKTA 純化儀檢測下,當紫外吸收值開始上升時收集洗脫下來的目的蛋白,當紫外吸收值下降至不再變化時停止收集。

        6、檢測洗脫液中蛋白濃度,參照考馬斯亮藍法測定蛋白濃度標準操作規程操作,根據洗脫液體積,計算出洗脫液中蛋白量。

        7、取樣電泳,參照電泳儀使用標準操作流程。

        注意事項

        1. 色譜峰對稱性差

        出峰上升時,上升緩慢是填料裝填過緊,而拖尾是因為裝填的太松,此時對稱因子及柱效都很差,出現這種情況就要重現裝柱。裝柱前要了解填料的壓縮系數(壓縮因子)如 Focurose FF 系列的填料的壓縮系數是 1.15,且裝完后要測柱效。

        2. 柱床有裂縫或干涸等塌柱現象

        檢測管路及柱床體系是否有泄露或氣泡,必要時重現裝柱。

        3. 分離度差

        (1) 樣品和選擇的填料不匹配

        待分離的樣品中目標物質和其它雜質的分子量小于 2 倍且都在選擇的填料的排阻極限之外或者之內。若樣品中目標物質的分子量和其它雜質的分子量小于 2 倍時,建議嘗試其它方法分離,反之選擇凝膠過濾層析時,填料的選擇應根據樣品中目標分子的大小選擇更加接近(大或小都可以)目標分子排阻極限的填料進行分離。

        (2) 柱床裝填的效果差

        通過測柱效等方式確保柱床裝填的滿足凝膠過濾層析的過程。

        (3) 上樣量過大

        根據樣品中目標物質和雜質的分子差異優化上樣量,如脫鹽等樣品中目標分子和雜質的分子量大于 50 倍時,上樣量可以達到柱床體積的 25%,最高不超過 30%,若樣品中目標分子和雜質的分子量差異在2-5倍時,通常上樣量控制在柱床體積的5%以內。

        (4) 流速過快

        凝膠過濾的過程流速不宜過快,降低流速在一定程度上可以提高分離度。

        (5) 層析填料被污染或老化

        隨著填料的使用,一些雜質的積累會使層析填料的孔徑發生變化(如堵塞,非特異性吸附積累,微生物污染,破碎等),導致其排阻能力發生偏差而影響分離度。此時可對填料進行 CIP 清洗,若清洗后還不能達到分離要求,就要更換新的填料。

        (6) 樣品自身的問題

        常見問題

        1、柱填充要均一,決不能出現氣泡。在裝柱時候要緩慢倒入凝膠,并輕輕敲打柱身趕走氣泡。

        2、柱上表面要平,平衡柱時間要長一些,讓凝膠充分沉積為均一的柱床。

        3、上樣體積要少,因此最好濃縮樣品。

        4、柱床上表面不能干燥,要有 1~2cm 流動相覆蓋。

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