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        疏水作用層析法(蛋白質純化實驗)原理及步驟

         發布時間:2023/7/10 點擊量:463

        原理

        在疏水層析的主要支持介質上含有大小不等的疏水側鏈,烷基或芳香基,可是絕大多數情況起作用的是苯基或辛基。當碳氫鏈長度增加,即變得更疏水時,疏水強的少量蛋白質被吸附。這時疏水相互作用太強,需用特殊方法洗脫,可能會導致蛋白質變性。苯基瓊脂糖比辛基瓊脂糖疏水性低,是疏水純化中效果不錯的常用介質,尤其是試用于純化開始時。

        疏水相互作用介質

        苯基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-C6H5

        辛基瓊脂糖-O-CH2-CHOH-CH2-O-(CH27-CH3

        溶液鹽濃度增加時疏水作用變得更強。因此,大多數疏水層析程序都是高鹽時上樣,降低鹽濃度時洗脫。所以在硫酸銨沉淀或離子交換層析后可以方便地直接進行疏水層析純化。溫和的洗脫條件及高蛋白質結合容置(10~100 mg/ml)使疏水層析在蛋白質純化中成為很有價值的方法,也是更換緩沖液的方法之一。

        材料與儀器

        蛋白質樣品液
        苯基瓊脂糖 CL-4B NaCl 硫酸銨 磷酸鈉鹽
        層析柱

        步驟

        下述方案設定樣品是在 75% 硫酸銨沉淀后溶在 50% 硫酸銨溶液的情況。

        1. 裝填 5 ml 苯基瓊脂糖 CL-4B 進入柱內;

        2. 10 倍柱床體積層析緩沖液(20 mmol/L,pH 7.0 磷酸鈉鹽,50% 硫酸銨)洗柱;

        3. 調整樣品液符合要求,即在 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液中含 50% 硫酸銨。上樣總蛋白量 200~500 mg;

        4. 3 倍柱床體積層析緩沖液洗柱或洗至 A280 值回到基線;

        5. 用分步梯度法洗脫。每步依次分別采用兩倍體積各含 40%、30%、20%、10% 或 0% 硫酸銨的 pH 7.0 磷酸鈉緩沖液洗脫;

        6. 再依次用 5 倍體積水、5 倍體積 1 mol/L NaCl 和 5 倍體積水洗柱,使其獲得再生。

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