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        GST 共結合純化法原理、試劑及實驗步驟

         發布時間:2023/7/10 點擊量:355

        原理

        瓊脂糖顆粒和誘餌蛋白復合體在洗滌時并不會損失而且所有反應都含有等量的誘餌蛋白。為了證明在洗滌期間沒有任何材料損失,應使用 1/10 的 GST 融合體加樣做平行 SDS-PAGE 凝膠電泳并染色以便更確切地比較 GST 融合體蛋白帶。另外,融合蛋白的降解可能導致誘餌蛋白的量減少,尤其是當使用粗提物(見圖 19.2.1)而不是純化標記的實驗蛋白時。在對結合實驗蛋白進行定量時必須將降解量計算在內。

        材料與儀器

        E.coli 提取物(溶于瓊脂糖顆粒結合緩沖液) [35S] Met 標記蛋白質 GST 融合蛋白(GST 和與瓊脂糖顆粒結合)
        1 × SDS 樣品緩沖液 凝膠固定液(10% 冰醋酸/45% 甲醇)
        離心機和 Beckman TLA-100轉子 微量離心機 4℃ X射線膠片/儲存磷光子屏 掃描光密度儀/磷光子顯像儀

        步驟

        1. E.coli 可溶性蛋白抽提物放置在冰上解凍。

        2. 每個反應取 500μl 解凍的 E.coli 提取物于 4℃,175000 g (使用 Beckman TLA-100 轉子為 70000r/min)離心 30 min。

        3. 轉移上清液(不小于 400 μl)到 2 個試管中,每管 200 μl,并冰浴保存。

        4. 在一支含 200 μl 步驟 3 獲得的上清液試管中加入 1~5 μl [35S] 甲硫氨酸標記的實驗蛋白,并冰浴 15 min。

        5. 4℃ 以最大速度微量離心 15 min,從體外轉錄混合物中除去不溶性蛋白質聚合體。將 200μl 上清液(含標記實驗蛋白和提取物)轉移到一個潔凈的試管中。

        6. 在另外一支含 200 μl 步驟 3 獲得的上清液加入 20 μl 與瓊脂糖顆粒結合的 GST 或 GST 融合蛋白(誘餌蛋白)并充分混勻。

        每個反應需要 2~5 μg GST 誘餌蛋白融合體。在每個反應中最好加入約 20 μl 瓊脂糖顆粒以便在 洗滌時可見到瓊脂糖顆粒的沉淀。然而,如果 20 μl 瓊脂糖顆粒結合的蛋白質超過 2~5 μg,即可補加未結合谷胱甘肽的瓊脂糖顆粒提供必要的體積。

        7. 將 200 μl 混勻的瓊脂糖顆粒提取物懸液(步驟 6)加到含實驗蛋白提取物(步驟 5)中。緩慢搖動于 4℃ 孵育 1~2 h。

        8. 4℃ 以最大速度微量離心反應物 1 min,沉淀瓊脂糖顆粒。移去上清液,瓊脂糖顆粒沉淀用 1 ml 瓊脂糖顆粒結合緩沖液洗滌,共洗 3 次。每次洗滌之后于 4℃ 以最大速度微量離心 1 min。最后一次洗漆后應小心移去所有液體。

        除去所有液體以確保在分析性 SDS-PAGE 凝膠上所加的樣品量相等??捎脭Q成條的薄型濾紙或帶很薄尖頭的 SDS 加樣吸頭除去最后遺留的幾微升液體。

        9. 在每支試管中直接加入 25 μl 1×SDS 樣品緩沖液并置沸水浴 5 min。做分析性 SDS-PAGE 凝膠電泳。

        所需樣品量依據不同的誘餌蛋白/靶蛋白對和檢測方式而不同。加入全部樣品可避免加樣體積的問題,因為這樣就不存在所加樣品與未加樣品間比率不確定的因素了。

        10. 可選:用考馬斯亮藍染色。

        11. 在凝膠固定液中于室溫將凝膠固定 30 min,緩慢振蕩。干膠并做放射自顯影或將它置于一個儲存磷光子的屏幕上。使用掃描光密度計或磷光子顯像儀對 X 射線片進行定性分析。

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