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        串聯親和純化技術法所用試劑、操作步驟及注意事項

         發布時間:2023/7/11 點擊量:403

        簡介

        串聯親和純化技術法是由 Rigaut 等于 1999 年建立的能快速研究體內蛋白質相互作用的新技術,用于在接近細胞真實生理狀態的條件下純化細胞體內的蛋白質復合體。

        材料與儀器

        器材:SDS- PAGE 電泳裝置、離心機、EP 管、水浴鍋。

        試劑:

        ① IgG Sepharose 6 Fast Flow matrix

        ② AcTEV protease

        ③ Calmodulin Affinity Resin

        ④ NP-40 緩沖液

        image.png

        ⑤ IPP150 緩沖液

         image.png

        ⑥ TEVCB 緩沖液

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        ⑦ CBB buffer0.1% 和 0.02%)

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         image.png


        ⑧ CEB buffer

         image.png

        步驟

        串聯親和純化技術法的基本過程可分為如下幾步:

         

        (一)細胞裂解及蛋白樣品的制備

         

        A. 懸浮細胞:1400 r/min,4℃ 離心 5 分鐘,用預冷的 PBS 3 次,按 1ml/107 個細胞加入 NP-40 裂解液,冰箱內垂直搖床裂解 60 分鐘,12000 r/min,4℃ 離心 20 分鐘,回收上清,即為細胞的蛋白裂解液。

         

        B. 貼壁細胞:用預冷的 PBS 3 次,加入 NP-40 裂解液 1ml90 mm 培養皿),冰上放置 10-60 分鐘,吹打細胞并移入 15 ml 離心管中,12 000r/min4℃ 離心 20 分鐘回收上清,即為細胞的蛋白溶解液。細胞裂解液短期可 4℃ 保存或-80℃ 長期保存。

         

        (二)IgG 親和層析

         

        A. 500μl IgG-瓊脂糖微珠和 NP-40 裂解液 11V/V)混合,加入上一步得到的上清中,4℃ 搖床孵育 3 小時。

         

        B. 4℃,1200r/min 離心 2 分鐘,緩慢除去上清,注意不要觸及底部沉淀。

         

        C. 用預冷的 IPP150 緩沖液洗沉淀 3 次,每次 10 ml。

         

        (三)TEV 酶切

         

        A. 將上一步得到的沉淀轉移至 1.5 ml 離心管中,用預冷 TEVCB 緩沖液洗滌三遍,每次 1 ml。

         

        B. 加入含有 20 個單位 AcTEV 蛋白酶的 TEVCB 緩沖液 1 ml,室溫反應 2 小時或 4℃ 搖床過夜。

         

        C. 12000r/min 離心 1 分鐘,收集上清(約 1 ml),轉移至 15 ml 離心管中。

         

        (四)鈣調蛋白親和純化

         

        A. 6ml 0.1CBB 緩沖液加入上一步得到的 IgG 純化洗脫液中。

         

        B. 250μl 的鈣調蛋白親和微珠,用 1ml 0.1CBB 緩沖液洗滌 3 遍。

         

        C. 微珠與 0.1CBB 緩沖液 11V/V)混合,加入到 IgG 純化洗脫液中,4℃ 搖床孵育 3 小時。

         

        D. 1200r/min 離心 2 分鐘,10ml 0.02CBB 緩沖液洗沉淀 3 次。

         

        (五)EGTA 洗脫

         

        A. 將上一步得到的鈣調蛋白微珠沉淀轉移至 1.5ml 離心管,加入 100-200μl CEB 緩沖液,4℃ 搖床孵育 2 小時。

         

        B. 1200r/min 離心 2 分,收集上清,用于 SDS-PAGE 或免疫印跡分析。

         

        (六)蛋白質電泳分離(SDS-PAGE

         

        A. 安裝電泳裝置和玻璃板。

         

        B. 配制分離膠:按照所需濃度和體積依次混合 H20,30% 丙烯酰胺,1.5mol/L TrispH8.8),10SDS,10% 過硫酸銨,最后加入 TEMED,立即快速混勻。

         

        C. 迅速在兩玻璃板間隙灌入分離膠溶液,留出沉積膠所需體積和梳子齒長高度。小心地在膠上覆蓋一層去離子 H20,垂直放置于室溫中,約 30 分鐘使膠凝聚。

         

        D. 倒出分離膠上方覆蓋液體,盡量吸干。

         

        E. 配制 5% 濃縮膠,依次混合 H20,30% 丙烯酰胺,1.5mol/L TrispH8.8),10SDS,10% 過硫酸銨,最后加入 TEMED,立即快速混勻。

         

        F. 在分離膠上方灌入濃縮膠,并插入梳子,避免氣泡!再灌入適量濃縮膠填滿梳子齒間縫隙,垂直放置于室溫。

         

        G. 將蛋白樣品加入等量 2 x SDS 加樣緩沖液,100℃ 加熱 3 分鐘使蛋白變性。2000r/min,常溫離心 3 分鐘。

         

        H. 取出濃縮膠中梳子,以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。將凝膠裝置固定于電泳裝置中,在上、下槽均加滿 Tris-Glysine 電泳緩沖液。

         

        L. 加樣 10-20μl。

         

        I. 將電泳裝置通電,電壓 8V/cm,當染料前沿進入分離膠后,電壓提高到 15V/cm,電泳至溴酚藍到達膠底部,約 2-4 小時。

         

        J. 關閉電源,取出玻璃板,撬開玻璃板,小心取出凝膠。

         

        7. 考馬斯亮藍染色或銀染。

         

        8. 質譜分析蛋白質復合物的組成。

        注意事項

        1.實驗設計 在開始 TAP 實驗前,需要考慮以下幾點:

        確認靶蛋白中不存在 TEV 酶的識別位點:EXXYXQGS);

        根據不同蛋白質的結構,確定 TAP 標簽位于靶蛋白的 N 端還是 C 端,以不影響靶蛋白的正常折疊和功能為準則;

        靶蛋白的表達量:通常不推薦使用過表達來進行 TAP 純化,這會影響細胞的生理環境,提高實驗假陽性,因此使用內源性啟動子較為合適;

        選擇適合的 TAP 標簽:最初的 TAP 標簽由 Protein A 和鈣調蛋白組成,但此標簽分子量較大,可能會影響靶蛋白的折疊;現已有由 Protein A Flag 等組成的 TAP 標簽,在保持高親和力的同時減少對靶蛋白的干擾,可以從優選擇;

        對照:比較好的對照是含有 TAP 標簽但不含有靶蛋白的細胞株,提高實驗特異性。

        2.由于整個實驗過程較長、步驟較多,建議在每步洗脫時留取少量洗脫液,在實驗結果不理想時可以幫助發現和解決潛在的問題。

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