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        Protein A/G 親和層析法純化單克隆抗體原理、步驟及注意事項

         發布時間:2023/7/11 點擊量:488

        簡介

        目前約 70~ 80% 的抗體純化使用 Protein A/G 親和層析法。Protein A IgG 的結合強度很大程度上依賴于該抗體的種屬和亞類,而 Protein G 對于大多數哺乳動物的 IgG 則有著更高的親和力,因此,Protein G 可用于純化不能與 Protein A 很好結合的哺乳動物單抗或多抗 IgG 的純化。

        原理

        Protein A/G 親和層析法純化單克隆抗體的基本原理是 Protein A/G 能特異性地與抗體的 Fc 段結合,因此 Protein A/G 親和層析柱可用于抗體(單抗和多抗)的分離純化,具有很高的選擇性。經過一步親和層析,即可從腹水、雜交瘤培養上清或免疫血清等樣品中得到高純度(> 95%)的抗體。

        材料與儀器

        器材:

        Protein A/G 親和層析柱,FPLC 層析系統


        試劑:

        上樣緩沖液:0.02 mol/L PBS,pH 7.4

        洗脫液:pH 3.0~4.0、0.02 mol/L 檸檬酸緩沖液或 pH 3.0、0.2 mol/L 甘氨酸 -HCL 緩沖液

        再生液:0.1 mol/L 乙酸

        步驟

        Protein A/G 親和層析法純化單克隆抗體的基本過程可分為如下幾步:


        A. 樣品預處理:小鼠腹水于 4 ℃、12000 r/min 離心 15 分鐘,以除去較大的凝塊。經上樣緩沖液倍比稀釋后,0.45 μm 濾膜過濾。

        B. 平衡:以 1 mL/min 的流速,用 5-10 倍層析柱體積的上樣緩沖液平衡層析柱,至流出液 pH 值為 7.4。

        C. 上樣:預處理過的腹水上層析柱,保持 1 mL/min 流速,繼續用上樣緩沖液流洗 510 倍層析柱體積至基線穩定(即雜蛋白wan全洗脫)。


        D. 洗脫:用洗脫液洗脫柱結合抗體,同時應用 FPLC 層析系統進行實時監測,當觀察到基線開始上升,即出現洗脫峰時,每管 3 mL 收集流出液,直至洗脫峰回到基線,并立即用 1.0 mol/L pH 9.0 Tris-HCL 緩液調整收集的各管流出液 pH 值至 7.0。


        E. 再生:保持 1 mL/min 流速,用 35 倍層析柱體積的再生液淋洗柱子。


        F. 平衡:繼續用 510 倍層析柱體積的上樣緩沖液重新平衡層析柱,至流出液的 pH 呈中性,再用 10 倍層析柱體積的三蒸水平衡,可重復使用。
        G. 濃縮:合并調至中性的各管洗脫液,采用超濾離心管進行濃縮,最后以 0.15 mol/L PBSpH 7.4)調整到合適體積,進行 SDS-PAGE 鑒定純度,BCA 法進行抗體定量,分裝凍存。

        注意事項

        1. 純化前所有緩沖液、樣品及層析柱都必須平衡至室溫,以避免產生氣泡。


        2. 純化前樣品、緩沖液須用 0.45 μm 濾膜過濾去除顆粒性物質,以防層析柱被堵塞而降低純化效果。


        3. 使用經飽和硫酸銨粗純的樣品不僅可獲得更好的純化效果,還可適當延長親和層析柱的使用壽命。


        4. 加樣后,讓樣品在親和柱內滯留一定時間(約 30 分鐘)可提高親和柱的純化效率。


        5. 在酸性條件下洗脫的抗體必須立即中和到中性(pH 7.0 左右),以利于維持抗體的生物學活性,避免抗體失活。


        6. 在使用和保存層析柱時,應避免柱內液體流干,以防氣泡進入。


        7. 為確保層析柱的使用壽命和載量,及時清洗非常重要,清洗完成后用上樣緩沖液重新平衡。


        8. 層析柱可于 4 ℃、20% 乙醇中長期保存。

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