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        包含體蛋白質提取和純化的原理和操作步驟

         發布時間:2023/7/11 點擊量:400

        簡介

        在利用大腸埃希菌表達重組蛋白時,經常會得到包含體。包含體分離純化難度大,只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質需要重新復性(renaturation),才能折疊成正確的天然構象和恢復原有的生物活性。

        原理

        包含體是細胞感染病毒后胞漿或核中出現的特殊結構。 常用于病毒病的診斷。 根據病毒種類,包含體表現大小不一,形態各異,單一或多個,嗜酸或嗜堿。 它代表著病毒粒子的合成場所,故又稱病毒工廠(virus factory)或病毒原質體(viroplasma)。包含體分離純化難度大,只有在變性后才能形成可溶性的形式予以純化。純化后的變性蛋白質需要重新復性(renaturation),才能折疊成正確的天然構象和恢復原有的生物活性。

        材料與儀器

        試劑:

         

        溶菌酶、EDTA、Tris、去垢劑 Triton X-100、尿素

         

        儀器:

         

        超聲破碎儀、離心機、凝膠層析柱、透析袋

        步驟

        (一)裂菌、洗滌及溶解

         

        1.裂菌利用溶菌酶破碎細菌的細胞膜,再結合超聲破碎方法裂解細菌。細菌裂解后,500020000 g 離心 15 分鐘,可以使大多數包含體沉淀,與可溶性蛋白分離開。

         

        2.洗滌為了棄除包含體上黏附的雜質,通常用低濃度的變性劑,如含 2mol/L 尿素的 1 mmol/LEDTA50 mmol/L Tris,pH7.08.5)洗滌。過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包含體溶解。溫和的去垢劑 Triton X-100 和脫氧膽酸也可以棄除膜碎片和膜蛋白。

         

        3.溶解利用 68 mol/L 尿素或 58 mol/L 鹽酸胍將包含體溶解。鹽酸胍是強于尿素的變性劑。

         

        (二)變性蛋白質的復性

         

        1.復性過程蛋白質在尿素濃度為 4 mol/L 時開始復性,到 2 mol/L 時復性結束。對于鹽酸胍而言,從濃度為 4 mol/L 開始復性,到 1.5 mol/L 時復性結束。常用的包含體蛋白質復性方法有疏水層析柱復性和凝膠層析柱復性兩類。凝膠層析柱復性均用 Sephacryl S-100 Superdex 75 等層析介質,層析柱的長度為 40100 cm。層析柱復性回收率高(高達 90% 以上)、速度快、易于放大、樣品稀釋倍數?。ㄒ话?5 倍左右)。

         

        2.復性效率蛋白質復性取決于蛋白質本身的特性以及所處的環境。有些蛋白非常容易復性,如牛胰 RNA 酶的復性效率可以達到 95% 以上,但有一些蛋白至今還沒有發現能夠使其復性到天然構象的理想方法。純化白細胞介素-2 時,以 SDS 溶液中加入銅離子(0.05% SDS,7.530 μmol/L CuCl2)的方法,2537 ℃ 下反應 3 小時,再用 1 mmol/L EDTA 終止反應,復性后的二聚體低于 1%。一般說來,蛋白質的復性效率應在 20% 左右。

         

        3.影響復性效率的因素復性緩沖液的最適 pH 8.09.0,最適溫度為 4 ℃,復性時間一般為 2436 小時。復性時的蛋白質濃度應該控制在 0.10.5 mg/ml,過高的濃度會影響到復性。在磁力攪拌下,逐滴將變性的蛋白質加入復性液中,使變性的蛋白質在復性緩沖液中始終處于低濃度狀態。如果過快地將變性蛋白質加入到復性緩沖液中,容易形成絮狀沉淀,這是蛋白質重新凝聚的前兆。

         

        復性完畢后,蛋白質要裝入透析袋,在低濃度的緩沖液中連續緩慢透析 1224 小時;透析不能太快;透析前后均要離心。

         

        4.提高包含體蛋白復性產率的方法在包含體蛋白質復性過程中,加人促進劑可以增加折疊復性中間體的溶解性,導致形成穩定的、具有正確天然結構的蛋白質。

         

        1)添加氧化交換系統:對于含有二硫鍵的蛋白,復性過程通過氧化交換系統可以促使不正確的二硫鍵配對發生快速交換反應,從而提高了正確配對的二硫鍵的產率。常用的氧化交換系統有谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、DTT/GSSG 等,其中 GSH/GSSG 最為常用。通常使用 13 mmol/L 還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為 10:15:1。

         

        2)添加小分子化合物:小分子化合物通過破壞錯誤折疊中間體的穩定性,或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復性產率,如鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類等,在非變性濃度下是很有效的促進劑。蛋白質的輔助因子 Zn  Cu 可以穩定蛋白質的折疊中間體,防止蛋白質的聚集。濃度大于 0.4 mol/L Tris 緩沖液可提高包含體蛋白質的折疊效率,濃度為 0.40.6 mol/L L-Arg 有助于增加復性中間產物的溶解度。硫代甜菜堿類物質(non-detergent sulfobetaines,NDSBs)是近年來出現的可促進蛋白復性的新家族,NDSBs 由一個親水的硫代甜菜堿及一個短的疏水基團組成,不屬于去垢劑,易于透析去除。目前常用的有 NDSB-195,NDSB-201 NDSB-256。

         

        3)添加分子伴侶和折疊酶:研究得比較透徹的分子伴侶有 Hsp60/GroE Hsp70/DnaK。折疊酶包括硫氧還蛋白二硫鍵異構酶、肽酰輔氨酰順反異構酶等。但這類蛋白在折疊復性后要除去,而且十分昂貴,因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。

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