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        利用Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法分離純化 IgG1

         發布時間:2023/7/12 點擊量:365

        簡介

        Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 是利用在中性 pH 環境中 Q SepharoseFast Flow 更傾向于結合小鼠腹水中的非目的蛋白,故在用鹽溶液梯度洗脫時,McAb 會較早被洗脫或出現在穿過液中,從而可得到分離純化的 IgG1。

        原理

        Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 的基本原理是 Q Sepharose Fast Flow 為強陰離子交換介質,具有流速快(最高流速 750 ml/min)、高量(120 mg HAS/ml)的特點。

        小鼠 IgG1 PI 范圍為 pH7.08.5,而白蛋白和轉鐵蛋白的 PI 范圍為 pH4.7-5.0,因此,在中性 pH 環境中 Q SepharoseFast Flow 更傾向于結合小鼠腹水中的非目的蛋白。故在用鹽溶液梯度洗脫時,McAb 會較早被洗脫或出現在穿過液中,從而可得到分離純化的 IgG1。

        材料與儀器

        器材:0.45μm 濾膜、XK 16/20 層析柱,FPLC 層析系統。

         

        試劑:

         

        ① Q Sepharose Fast Flow 強陰離子層析分離填料。

        起始緩沖液:0.02mol/L Tris-HCl 緩沖液,pH7.5。

        洗脫緩沖液:1.0mol/L NaCl-0.02mol/L Tris- HC1 緩沖液,pH7.5。

        再生溶液:0.1mol/L NaOH。

        步驟

        Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析法純化 IgG1 的基本過程可分為如下幾步:

         

        1)樣品準備

        A 小鼠腹水離心去雜質,飽和硫酸銨鹽析并除鹽,0.45μm 濾膜過濾。

         

        2)分離純化

        A 按照 Q Sepharose Fast Flow 生產廠家提供的說明書處理填料,按照 XK 16/20 層析柱使用說明書進行裝柱。

        B 5 ml/min 的流速,用起始緩沖液充分平衡層析柱,至流出液的 pH 值與初始緩沖液相同,約 3 倍層析柱體積,走出一穩定基線。

        C 上樣后,采用 2 ml/min 的流速,以 2-3 倍層析柱體積的起始緩沖液洗掉非結合蛋白,即穿過液中檢測不到蛋白峰。

        D 5 ml/min 的流速加入洗脫緩沖液,則 NaCl 濃度形成連續梯度,IgG1 將首先被洗脫而流出層析柱。

        E 純化的 McAb 可經超濾離心管濃縮,BCA 法測定 McAb 蛋白含量,分裝凍存。

        F 洗脫結束后,以 5 ml/min 的流速,2-5 倍層析柱體積的再生溶液對層析柱進行再生。用初始緩沖液重新平衡層析柱,以備下次使用。

        注意事項

        1.純化前所有緩沖液、樣品及層析柱都必須平衡至室溫,以避免產生氣泡。

        2.純化前樣品、緩沖液須用 0.45μm 濾膜過濾去除顆粒性物質,以防層析柱被堵塞而降低純化效果。

        3.不同類 McAb 的等電點變化范圍較大,即使在同一類的不同亞類 McAb 之間,其等電點也有較大差異(表 1-3)。因此,在純化不同類或亞類的 McAb 時,還須進行純化條件的優化。

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        4. 為確保層析柱的使用壽命和載量,及時清洗非常重要,清洗完成后用起始緩沖液重新平衡。

        5. 層析柱可于 4℃、20% 乙醇中長期保存。

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