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        內溶素的克隆、誘導表達與純化

         發布時間:2023/7/12 點擊量:392

        簡介

        作為噬菌體衍生的酶,內溶素本質是一種蛋白分子,其通過分解細菌細胞壁的肽聚糖成分,幫助噬菌體顆粒從細菌宿主釋放,可在噬菌體復制過程中表達,破壞細菌細胞壁肽聚糖的關鍵化學鍵。

        原理

        通過內溶素的蛋白表達、純化能夠將內溶素基因克隆到表達載體(如 pET28a),進一步轉化大腸桿菌進行擴增,重組質粒經 IPTG 誘導表達,得到經鎳柱純化的內溶素蛋白。

        用途

        為治療抗生素耐藥的細菌感染提供潛在解決方案。

        材料與儀器

        儀器:

        離心機、超聲破碎儀

        恒溫搖床、恒溫培養箱、PCR 儀、電泳儀

        凝膠掃描儀、鎳柱純化系統、0.22 μm 濾膜

        試劑:

        質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒

        核酸內切酶、T4 連接酶、Pfu 聚合酶

        IPTG、考馬斯亮藍

        步驟

        1)內溶素的克隆

        1、引物設計:對待研究的內溶素完成基因組測序注釋工作,根據已測基因組進行引物設計 P1 P2,并引入酶切位點。

        2、PCR 擴增內溶素基因:反應體系與程序見表 1。

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        3、PCR 反應條件:95 ℃ 預變性 5 min,95 ℃ 變性 30 s,Tm 溫度下退火30 s,72 ℃ 延伸 30 s,共 30 個循環,72 ℃ 最后延伸 10 min,26 ℃ 再反應 2 min(終止反應)。

        4、回收 PCR 產物膠:進行瓊脂糖凝膠電泳,將 50 μL 全部上樣,切下目的基因條帶,使用膠回收試劑盒回收目的基因(一般實驗室都會有常用品牌)。

        5、抽提質粒:使用質粒抽提試劑盒抽提載體質粒(一般實驗室都會有常用品牌)。

        6、對位點進行酶切:利用一開始設計好的酶切位點對載體與目的基因進行雙酶切,在 37 ℃ 下反應 3 h。

        7、切膠回收:將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳,切取含 DNA 片段的目的條帶并進行回收,得到 DNA 后檢測其濃度并保存在 -20 ℃ 冰箱備用。

        8、DNA 與載體連接:用 T4 連接酶連接載體與 DNA 片段,在 16 ℃ 下過夜。

        9、轉化大腸桿菌:取 50 μL 大腸桿菌 BL21 感受態細胞,加入 5 μL 連接液后冰上孵育 30 min,搖勻后 42 ℃ 水浴熱休克 90 s,然后迅速冰浴 2 min,冰浴后再加入已經預熱的 1 mL LB 培養基,37 ℃ 搖床震蕩 1 h 復蘇,最后涂板至卡那霉素抗性的平板,37 ℃ 溫度下培養過夜。次日挑取單菌落進行菌落 PCR,將陽性菌落接種于培養基中 37 ℃ 溫度下培養過夜。

        10、抽提質粒并進行雙酶切驗證(參見 5、6 步)。

        2)內溶素的表達與純化

        1、少量誘導表達:挑選單菌落過夜培養,過夜菌接種至 1 mL 培養基,37 ℃ 培養 2~3 h,再加入 10 μL 0.1 M IPTG 16 ℃ 誘導 4 h,取 20 μL 菌液加入 7.5 μL 的蛋白緩沖上樣液,100 ℃ 沸水煮 10 min 后電泳,倒入考馬斯亮藍過夜震蕩,清洗后尋找發現目標蛋白條帶存在,進一步擴大培養。

        2、擴大培養:將陽性菌落涂布平板過夜,挑選單菌落接種至 10 mL 培養基,37 ℃ 培養 6 h,按  1:100 比例接種于 500 mL 培養液中,37 ℃ 搖床至 OD600 值為 0.6~0.8,加入終濃度為 1 mM IPTG 誘導劑,在 16 ℃ 下繼續培養 12 h。

        3、細胞破碎:菌液離心 10 min4000 g,4 ℃),重懸于 30 mL PBS,加入 PMSF tritonX-100 冰浴 1 h 后超聲破碎,破碎菌液在 4 ℃ 轉入 50 mL 離心管,12000 rpm 離心10 min,取上清液用 0.22 μm 濾膜過濾雜質。

        4、蛋白純化:采用 Ni-NTA 純化系統進行鎳柱親和層析純化目的蛋白,純化后跑電泳,分析蛋白純度。

        注意事項

        1. PCR 條件與程序需要根據實驗進行梯度摸索。

        2. T4 連接酶在高溫不穩定,通常 16 ℃ 連接過夜,在 25 ℃ 左右的室溫能維持七八個小時。

        常見問題

        蛋白誘導表達效果不好(蛋白誘導表達條件并不一定適用所有實驗室,需要自己做實驗摸索條件)。

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