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        刀豆素 A 親和柱純化蛋白質的原理、步驟及注意事項

         發布時間:2023/7/17 點擊量:338

        原理

        用于親和層析的凝集素應根據它們結合的特異性和緊密度加以選擇。例如,刀豆素 ACon A)與糖蛋白含有的葡萄糖或甘露糖結合,而麥芽凝集素只與具 N-乙酰葡糖胺的蛋白質結合。胞膜糖蛋白常與麥芽凝集素結合,而可溶性糖蛋白卻通常用 Con A 或扁豆凝集素親和柱純化。由于在許多情況下被純化的糖蛋白的結構和特性不清楚,所以篩選一些凝集素與目的蛋白的結合狀況常常是有用和必要的。用于此目的的凝集素試劑盒也可購得。

        凝集素親和層析相對易于操作??捎迷S多方法將凝集素固相化到介質。溴化氰偶聯是普遍采用的方法。每 ml 介質材料能偶聯凝集素。偶聯時含有適宜的二價離子(0.1 mmolL)和保護性糖類(5%,wv)是關鍵。保護性糖類在偶聯過程中使結合部位不易接近而受到保護。許多凝集素親和柱也可從市場購得。

        以下步驟以介紹刀豆素 A 親和柱純化蛋白質為例,其他凝集素親和柱的純化步驟基本相似,只要換成適宜的洗脫用糖。相對長而細的層析柱有更好的分辨率,短而粗的柱子在小體積洗脫時具有更快的流速。小的試驗柱(例如裝填在巴斯德吸管內的)或在小離心管內進行的層析試驗可用于估算柱的結合容量。

        材料與儀器

        糖蛋白樣品液
        甲基-α-D-甘露糖 NaCl NaN3 Tris-HCl NaCl Mncl2 CaCl2 辛糖苷
        層析柱

        步驟

        1. 制備刀豆素 A 親和柱;

        2. 10 倍柱體積的層析緩沖液(20 mmolL ,pH 8.0 Tris-HCl,0.15 molL NaCl,1 mmolL MnCl2,1 mmolL CaCl2,30 mmolL 辛糖苷)平衡裝好的親和柱;

        3. 糖蛋白樣品液對層析緩沖液透析或用該緩沖液 11稀釋,然后離心或過濾除去沉淀;

        4. 將調整好的糖蛋白樣品液上樣到親和柱;

        5. 用層析緩沖液洗柱至 A280 值回到基線;

        6. 5 倍柱體積含10 mmolL 甲基-α-D-甘露糖的層析緩沖液洗脫;

        7. 繼續分別用 5 倍柱體積含 20、50、100、250500 mmolL 甲基-α-D-甘露糖的層析緩沖液洗脫;

        8. 檢測目的蛋白組分。匯集的目的蛋白組分透析除去糖;

        9. 用含 1 molL NaCl 的層析緩沖液洗柱,以獲得再生;

        注意事項

        一些凝集素在它們的結構整合中需要某些二價離子。因為凝集素親和層析常常涉及膜蛋白質,故經常需要去垢劑以保持這些蛋白質的可溶性。雖然凝集素對非離子型去垢劑相當寬容,但是離子型去垢劑減少它們的特異結合。

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