• <tbody id="t1qvn"></tbody>
  • <bdo id="t1qvn"><dfn id="t1qvn"></dfn></bdo>
  • <bdo id="t1qvn"></bdo>
    <track id="t1qvn"><span id="t1qvn"></span></track>

      1. <option id="t1qvn"></option>
        免費咨詢熱線:
        4008883135
        資料下載
        首頁 > 資料下載 > 分離純化蛋白質內序列分析用肽段的材料與步驟

        分離純化蛋白質內序列分析用肽段的材料與步驟

         發布時間:2023/7/17 點擊量:342

        材料與儀器

        材料與設備

        考馬斯亮藍 G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液)

        乙酸 (5% 10% 甲醇溶液)

        甲醇 (50% 的水溶液和 10% 的水溶液)

        SpeedVac 型旋轉濃縮器(Savant Instruments,Inc.)

        Achromobacter 胰蛋白酶 I〔賴氨酰內肽酶;50ng/ul 0.1mol/LTri-HCl(pH9.0)

        Tween-200.1% 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0) 溶液〕

        UltrafreeTM MC 濾器(22um;Millipore Corp.)

        CF3COOH(TFA;0.1% 50% 乙腈溶液)

        C18 反相 HPLC (2.1X250 mm;5um,300A)(VYDAC)

        乙腈

        2-丙醇

        步驟


        操作流程如下:

        1) SDS-PAGE 分離待研究蛋白。

        2) 凝膠用 0.05% 考馬斯亮藍 G 染色 15~30 min。

        3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脫色。

        4) 在水中浸泡 10 min。

        5) 從凝膠上切下蛋白帶,轉移至微量離心管。切下一段不含蛋白質的凝膠作對照。如必要,可將凝膠切成較小的碎片,使之能容易地沉入微量離心管的底 部。

        6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。

        7) 各管加入1ml 10% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。

        8) 凝膠碎片在 SpeedVac 型旋轉濃縮器中干燥 2 min。

        9) 各管加 10ul Achromobacter 蛋白酶 I。

        10) 各管加最小體積的含 0.1%Tween-20 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0)—剛夠淹沒凝膠碎片即可。
        注:凝膠碎片會膨脹, 故重要的是要保證它們仍能淹沒在含去垢劑的緩沖液中。

        11) 各管 30℃ 孵育 24 小時。

        12) 各管在微量離心機中離心,將各管上清轉移至 22-um Ultrafree MC 濾器內。12000r/min 離心 2 min。保留濾液。

        13) 1 體積含 0.1%TFA 50% 乙腈溶液于各管留下的凝膠碎片中--足夠淹沒凝膠碎片。4°C 孵育 30 min。

        14) 重復第 12、13 步操作。合并各樣品的濾液。

        15) 樣品在 SpeedVac 型旋轉濃縮器中旋轉濃縮至體積小于 100 ml。加適量 HPLC 平衡液,制成供 HPLC 分析用的樣品。

        16) 用反相 HPLC C18 柱分離消化液中的肽段。用含 0.09% TFA 的乙腈/2-丙醇 (3:1) 梯度洗脫肽段。于 214mn(對肽鍵)和 295nm(對色氨酸)檢測肽段的 UV 吸收。


        北京百奧創新科技有限公司提供BioToolomics蛋白質內序列分析用純化肽段產,更多有關蛋白質內序列分析用純化肽段產品及資料,請聯系百奧創新客服!

        文件下載    圖片下載    
        自偷自拍黄色影院