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        高效液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體的原理、步驟、注意事項

         發布時間:2023/7/17 點擊量:316

        原理

        根據離子交換原理,將經硫酸銨粗提的含McAbγ球蛋白上樣結合于層析柱上,通過增加洗脫液中的離子強度,洗脫并收集蛋白峰。

        材料與儀器

        PBS
        緩沖液
        層析柱 高效液相色譜儀

        步驟

        1. 腹水10000 g離心10 min,除去細胞和雜質,在4 ℃條件下逐滴加入飽和硫酸銨溶液,使終濃度為40 %飽和硫酸銨攪拌2030 min


        2. 離心,沉淀用40 %飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS,對緩沖液APH8.5 20 mM Tris緩沖液)透析除鹽4 ℃過夜


        3. 用帶有1000 μl樣品環的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經緩沖液A液平衡的TSK DEAE SPW離子交換層析柱

                        

        4. 洗脫流速1 ml/min

        01 min0→5%緩沖液B20 mM Tris,PH8.5,含2.0 M醋酸鈉)

        120 min(線性梯度洗脫):5→20%緩沖液B

        2022 min20→0%緩沖液B

                        

        5. 洗脫液用紫外280 nm進行監測

                        

        6. 收集蛋白峰,進行含量、純度和活性測定

        注意事項

        1. 所用緩沖液和加樣粗提物均需0.22 μm濾膜過濾。


        2. 在本實驗條件下,IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始1112 min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb的存留時間(retention time)有所差異。

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