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        谷胱甘肽S-轉移酶融合蛋白的表達及純化步驟

         發布時間:2023/7/17 點擊量:356

        材料與儀器

        大腸桿菌
        氨芐青霉素 LB PBS SDS 甘油 谷胱甘肽
        離心機 搖床 轉子 超聲波發生器

        步驟

        1. 按正確讀框將DNA片段亞克隆入合適的pGEX載體中,轉化大腸桿菌感受態細胞, 在LB/氨芐青霉素平皿上篩選轉化子,以不插入外源DNA的自連載體作對照,平皿置37℃孵育12~15 h。

        2. 挑取轉化菌落接種于2 ml LB/氨芐青霉素培養基,并在氨芐青霉素主平板上劃線培養。同時接種含母本pGEX載體的轉化菌作對照。將主平板于37℃下溫育12~15 h。液體培養物則于37℃搖床中振蕩培養,直至混濁。


        3. 加入100 mmol/l IPTG至終濃度0.1 mmol/l 誘導融合蛋白表達,繼續保溫培養1~ 2 h。

        4. 將液體培養物移入一個作好標記的微量離心管中,室溫下以最高速度離心5 s,棄上清,沉淀用300 μl 冰浴預冷的PBS液重懸。取10 μl 入另一個作好標記的離心管中 。

        5. 用帶直徑2 mm 探頭的超聲波發生器破碎細胞,4℃下高速離心5 min,除去不溶性物質, 將上清移入一新的離心管中。

        6. 毎管上清加50 μl 50%谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液,室溫下輕柔混勻,加1 ml PBS用旋渦混合器短暫振蕩旋起,高速離心5 s,收集瓊脂糖珠,棄去上清,重復用PBS洗滌2次。

        7. 往冼過的瓊脂糖珠中加等體積的1×SDS樣品緩沖液,另加入30 μl 10 μl 的全細胞 重懸液中,100℃加熱3 min,用旋渦混合器短暫振蕩旋起后,加樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上,電泳適當時間,用考馬斯亮藍染色使GST蛋白和融合蛋白顯跡。

        8. 挑取一個pGEX轉化菌落接種于100 ml LB/氨芐青霉素培養基中,在37℃搖床中培養12~15 h。

        9. 110比例將此培養物稀釋于1 L 新鮮的LB/氨芐青霉素培養基中,分入兩個2 L 的瓶中,37℃下培養1 h。


        10. 100 mmol/l IPTG至終濃度0.1 mmol/l,繼續培養3~7 h。

        11. 室溫下5 000 g 離心10 min,收集細胞,棄上清。沉淀重懸于10~20 ml 冰浴預冷的PBS中。

        12. 將離心管置于冰浴,用帶直徑5 mm 探頭的超聲波發生器裂解細胞,調整頻率和強度避免產生泡沫,伹使裂解于30 s 內完成。


        13. 加入10%Triton X-100至濃度為1%并混勻。室溫下10 000 g 離心5 min 除去不溶性成份和未裂解的細胞?;蛉?/span>1.5 ml 一份的樣品,4℃以微量離心機在最大速度離心5 min,收集上清(小心避免吸入沉淀)。

        14. 上清加入1 ml 50%的谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液中,室溫下輕柔混勻≥2 min。加50 ml 冰浴預冷的PBS液洗滌、混勻,在臺式離心機上500 g 離心10 s。重復洗滌2次,用少量(1~2 ml)冰冷的PBS重懸瓊臘糖珠,并移入一個1. 5 ml 微量離心管中。

        15. 室溫下500 g 離心10 s,收集瓊脂糖珠,棄上清。加1 ml 50 mmol/l Tris·ClpH8.0/5 mmol/l 還原型谷胱甘肽冼脫融合蛋白。輕柔混勻2 min,500 g 離心10 s,收集上清, 重復冼脫2~3次,經SDS-PAGE分析各分部收集的樣品。洗脫的蛋白質分成小份,加甘油10%貯存于-70℃。測量280 nm 下的吸光度確定融合蛋白產量,對GST載體來說,A280=1相當于蛋白質濃度為0.5 mg/ml。

         

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